در مقاله قبل با تعریف الکتروفیزیولوژی و انواع تکنیک‌های الکتروفیزیولوژی کلاسیک آشنا شدیم، در مطلب پیش رو نگاهی خواهیم انداخت به انواع تکنیک الکتروفیزیولوژی که این روزها محققان و دانشمندان از آن استفاده می‌کنند. برای درک بهتر این مطلب ابتدا مقاله الکتروفیزیولوژی چیست؟ را بخوانید.

به منظور اندازه‌گیر‌ی و ثبت پتانسیل‌های بدن، نیاز به واسطه‌ای بین بدن و سیستم ثبت سیگنال داریم. الکترودهای پتانسیل حیاتی باید توانایی هدایت یک جریان مابین بدن و سیستم ثبت سیگنال را داشته باشد.

الکترود مبدلی است که جریان یون‌ها در داخل بدن را به جریان الکتریکی در سیم‌ها تبدیل می‌کند. روش‌های مختلف الکترود گذاری در بدن، بافت و سلول زنده را انواع تکنیک الکتروفیزیولوژی می نامند.

انواع تکنیک الکتروفیزیولوژی

در ادامه با انواع تکنیک‌های الکتروفیزیولوژی درون سلولی، که در واقع همان انواع الکترود گذاری و ثبت داخل سلولی است آشنا می شوید.

تکنیک الکتروفیزیولوژی نوری

در بین انواع تکنیک الکتروفیزیولوژی روش الکتروفیزیولوژی نوری توسط دانشمندان و مهندسان ایجاد شده است، تا بر یکی از محدودیت‌های اصلی تکنیک‌های کلاسیک غلبه کنند.

تکنیک‌های الکتروفیزیولوژی کلاسیک، تقریباً امکان مشاهده فعالیت الکتریکی را تنها در یک نقطه از حجم یک بافت فراهم می‌کنند. در اصل، تکنیک‌های کلاسیک یک قسمت از بافت یا یک پدیده را انتخاب کرده و از سایر بخش‌ها مجزا می‌کنند.

علاقه به توزیع مکانی فعالیت بیوالکتریک، باعث ایجاد و توسعه مولکول‌هایی شد که قادر به انتشار نور در پاسخ به محیط الکتریکی یا شیمیایی خود باشند. این دست مولکول‌ها مانند، رنگ‌های حساس به ولتاژ و پروتئین‌های فلورسانس هستند.

بعد از معرفی کردن یک یا چند نمونه از این چنین ترکیبات و ماده‌ای، از طریق تزریق وریدی، تزریق یا بیان ژن، می توان توزیع ۱ یا ۲ بعدی فعالیت الکتریکی را مشاهده و ثبت کرد.

انواع تکنیک الکتروفیزیولوژی در ثبت داخل سلولی

ثبت داخل سلولی شامل اندازه گیر‌ی ولتاژ و یا جریان در سراسر غشای سلول است. برای ایجاد ثبت داخل سلولی، باید نوک ریز (تیز) یک میکروالکترود داخل سلول درج شود، تا پتانسیل غشاء اندازه گیر‌ی شود.

به طور معمول، پتانسیل بلقوه غشای یک سلول سالم در حالت استراحت ۶۰ تا ۸۰ میلی ولت خواهد بود و در طی یک عمل ممکن است پتانسیل غشای به ۴۰ میلی ولت برسد.

در سال ۱۹۶۳، آلن لوید هوچکین و اندرو فیلدینگ هاکسلی به دلیل همکاری‌شان در درک مکانیسم‌های اصلی تولید پتانسیل‌های عمل در نورون‌ها، برنده جایزه نوبل فیزیولوژی یا پزشکی شدند.

آزمایشات آنها شامل ثبت‌های درون سلولی از آکسون غول پیکر آتلانتیک (Loligo pealei) بود و در اولین برنامه‌های تکنیک “گیره ولتاژ” بودند.

امروزه بیشتر میکروالکترودهای مورد استفاده برای ضبط درون سلولی، میکروپیپت‌های شیشه‌ای، با قطر نوک کوچک‌تر از ۱ میکرومتر و مقاومت چند مگوم هستند.

میکروپیپت‌ها با محلولی پر شده اند که دارای ترکیب یونی مشابه به مایع درون سلولی سلول است. یک سیم نقره‌ای کلرید وارد شده به پیپت، الکترولیت را به طور الکتریکی به آمپلی فایر و مدار پردازش سیگنال متصل می‌کند.

ولتاژ اندازه گیر‌ی شده توسط الکترود با ولتاژ الکترود مرجع، که معمولاً یک سیم نقره با روکش کلرید نقره در تماس با مایع خارج سلولی در اطراف سلول است، مقایسه می شود.

به طور کلی، هرچه نوک الکترود کوچک‌تر باشد، مقاومت الکتریکی آن بیشتر است. بنابراین یک الکترود سازش بین اندازه (به اندازه کافی کوچک برای نفوذ در یک سلول منفرد با حداقل آسیب به سلول) و مقاومت (به اندازه کافی پایین است تا بتوان سیگنال‌های عصبی کوچک را از نویز حرارتی در نوک الکترود تشخیص داد) است.

گیره ولتاژ

تکنیک گیره ولتاژ (voltage clamp) از مکانیسم بازخورد منفی استفاده می‌کند. تقویت کننده بالقوه غشاء، ولتاژ غشاء را اندازه گیر‌ی می‌کند و خروجی را به تقویت کننده بازخورد می‌فرستد.

تقویت کننده بازخورد ولتاژ غشای را از ولتاژ فرمان، که از ژنراتور سیگنال دریافت می‌کند، کم می‌کند. این سیگنال تقویت شده و از طریق الکترود ثبت به سلول باز می گردد.

روش گیره ولتاژ به یک آزمایشگر اجازه می‌دهد تا پتانسیل سلول را در یک مقدار انتخاب شده و در یک سطح مشخص نگه دارد. این امر می‌تواند اندازه گیر‌ی کند که چه مقدار جریان یونی در هر ولتاژ معین، از غشای سلول عبور می‌کند.

این مسئله مهمی است، زیرا بسیاری از کانال‌های یونی در غشای یک نورون، از نوع کانال‌های یونی با ولتاژ دردار هستند، که فقط هنگامی که ولتاژ غشاء در یک محدوده مشخص است باز می شوند.

گیره ولتاژ پایه به طور تکراری پتانسیل غشای سلول را اندازه گیر‌ی می‌کند و سپس با اضافه کردن جریان لازم، به پتانسیل غشایی ولتاژ آن را به مقدار دلخواه تغییر می‌دهد.

این کار غشا سلولی را در ولتاژ ثابت مطلوب “گیره” می‌کند و به گیره ولتاژ امکان می‌دهد که چه جریان‌هایی را تحویل دهد.

گیره جاری

در تکنیک گیره جاری (Current clamp) به وسیله تزریق کردن جریان داخل یک سلول، از طریق الکترود ثبت، میزان پتانسیل غشا را ثبت می کند.

برعکس حالت گیره ولتاژ، یعنی روشی که پتانسیل غشاء در سطح مشخص شده توسط آزمایشگر نگه داشته می شود، در حالت “گیره جاری” پتانسیل غشاء متفاوت و به صورت آزاد است و آمپلی فایر هر ولتاژی که سلول خود تولید می کند یا نتیجه تحریک است را ثبت می کند.

این روش برای بررسی نحوه پاسخ سلول در هنگام ورود جریان الکتریکی به سلول استفاده می شود. این مسئله به عنوان مثال برای درک چگونگی واکنش نورون‌ها به انتقال دهنده‌های عصبی که با باز کردن کانال‌های یونی غشایی عمل می کنند مهم است.

تکنیک گیره-وصله

گیره-وصله (patch-clamp) متصل به سلول، از یک میکروپیپ متصل به غشای سلولی استفاده می کند، تا امکان ثبت از یک کانال یونی واحد فراهم شود.

این تکنیک توسط اروین نر (Erwin Neher) و برت ساکمان (Bert Sakmann) تهیه شده است که در سال ۱۹۹۱ جایزه نوبل را دریافت کردند.

ثبت داخل سلولی معمولی شامل وارد شدن به داخل سلول با یک الکترود ریز است. اما ثبت patch-clamp رویکرد متفاوتی را اتخاذ می کند.

میکروالکترود patch-clamp یک میکروپیپت با قطر نوک نسبتاً بزرگ است. میکروالکترود در محلی کنار سلول قرار می گیرد و مکش ملایمی از طریق میکروالکترود اعمال می شود، تا یک تکه از غشای سلولی را به سوی نوک میکروالکترود “patch” بکشد.

این وضعیت حالت “پیوست-سلول” است و می توان از آن برای مطالعه فعالیت کانال‌های یونی موجود در لکه غشایی استفاده کرد.

آشنایی با دستگاه elab و الکتروفیزیولوژی خارج سلولی در مدل حیوانی

انواع تکنیک الکتروفیزیولوژی و روش الکترود شارپ

در شرایطی که فرد می خواهد پتانسیل موجود در غشای سلولی را با حداقل تأثیر در ساختار یونی مایع درون سلولی ثبت کند، می توان از الکترود Sharp (تیز) استفاده کرد.

این میکروپیپت ها (الکترودها) باز هم شبیه همان patch-clamp هستند که غشای سلولی از طریق مویرگ‌های شیشه ای کشیده می شوند، اما منافذ بسیار کوچکتر است به طوری که تبادل یونی بسیار کمی بین مایع درون سلولی و الکترولیت موجود در پیپت وجود دارد.

مقاومت الکترود میکروپیپت ده ها یا صدها MΩ است. غالباً نوک الکترود با انواع مختلفی از رنگ‌ها مانند لوسیفر به رنگ زرد پر می شود، تا سلول های ثبت شده از آنها پر شود.

و سپس برای تأیید بعدی مورفولوژی آنها در زیر میکروسکوپ مورد بررسی قرار می گیرد. رنگ‌ها با اعمال ولتاژ مثبت یا منفی، DC یا پالس شده بر روی الکترودها، بسته به تمایل قطبی رنگ تزریق می شوند.

تا اینجا با انواع تکنیک الکتروفیزیولوژی در ثبت داخل سلولی مختصری آشنا شدیم، در مقاله بعدی می توانید با انواع تکنیک الکتروفیزیولوژی در ثبت خارج سلولی نیز به طور خلاصه آشنایی پیدا کنید.